Influência de diferentes meios de cultura axênicos no crescimento, viabilidade e infectividade de Leishmania (Leishmania) infantum.
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2019
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Resumo
A leishmaniose visceral (LV) é um grave problema de saúde pública e está em crescente
expansão em várias regiões do mundo. É considerada a forma mais grave das leishmanioses,
que se não diagnosticada ou não tratada pode levar ao óbito. Duas espécies são as
responsáveis pela LV no mundo sendo a Leishmania (L.) donovani principal causadora da
doença no Velho Mundo e Leishmania (L.) infantum, causadora da LV no Novo Mundo.
Durante seu ciclo biológico, o parasito apresenta-se em dois principais estágios morfológicos
diferentes: as promastigotas extracelulares presentes no hospedeiro invertebrado e as
amastigotas intracelulares presentes no hospedeiro vertebrado. Ambas as formas
morfológicas são passíveis de cultivar em condições laboratoriais em meios de cultura
axênicos que, assemelham às propriedades e condições observadas no inseto. E, a partir
dessa capacidade de se conseguir isolar e cultivar estes parasitos foi possível desenvolver
grande parte do conhecimento sobre estes. Assim, em nosso estudo propusemos a utilização
de diferentes meios de cultura (Grace’s®
, LIT e Schneider’s®
) com diferentes suplementações
(sem suplementação, suplementado com albumina 10% e suplementado com SFB 10%) com
o objetivo de verificar se tais modificações influenciam no crescimento, morfologia, viabilidade
e infectividade de parasitos afim de determinar o meio de cultura mais indicado para aplicação
destes parasitos em desafios experimentais para testes de fármacos e vacinas, tanto in vitro
quanto in vivo. Para isso, foram realizadas curvas de crescimento a partir de um inóculo de
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formas promastigotas do gênero Leishmania infantum cepa OP46
(MCAN/BR/2008/OP46) nos diferentes meios com as distintas suplementações por 10 dias
de acompanhamento. Ao analisar as curvas de crescimento dos parasitos em todos os meios
de cultura com as diversas suplementações, foram observados distintos padrões no
crescimento. Foi observado que os meios LIT e Schneider’s®
na ausência e presença do SFB,
apresentaram crescimento semelhante, e apresentaram uma grande multiplicação de
parasitos. Já o meio Grace’s®
suplementado com SFB e todos os meios acrescidos de
albumina apresentaram crescimento mais reduzido. Em relação à morfologia, verificamos que,
nos primeiros dias (1º - 4º dia) da curva de crescimento as formas promastigotas em todos os
meios suplementados ou não, apresentaram-se alongadas, com flagelo livre e com intensa
motilidade. No meio Grace’s®
com suas três modificações e no Schneider’s® modificado ou
não, aparecem formas arredondadas a partir do 5º dia. Já no meio LIT essas formas
morfológicas começam a alterar entre o 5º e o 7º dia de cultivo em todas as modificações de
suplementação. Em relação à viabilidade, que foi determinada por meio da citometria de fluxo,
com marcação por iodeto de propídeo, pode-se constatar que no início da curva há uma alta
porcentagem de promastigotas vivas em todos os meios e em todas as diferentes
suplementações. Esse número começa a decair com o passar dos dias da curva de
crescimento. Além disso, observamos nos meios sem suplementação grande mortalidade dos
parasitos, na suplementação com albumina os parasitos parecem sobreviver por mais tempo
e nos meios acrescidos de SFB a viabilidade foi variável dependente do meio. Após
determinados os dias em que foi observado o maior número de promastigotas metacíclicas
(fase estacionária), foram realizadas infecções in vitro em células murinas da linhagem
J774.A1. Este procedimento foi realizado empregando-se duas técnicas distintas: citometria
de fluxo e microscopia ótica. Utilizou-se também uma estratégia da contagem do número de
amastigotas/macrófagos. Tal contagem demonstrou uma maior presença de amastigotas nos
meios em que o parasito havia sido cultivado na presença de SFB. Para a citometria de fluxo,
o índice de infecção foi acima de 80% para as promastigotas cultivadas no meio LIT acrescido
de SFB. Na microscopia ótica, o meio LIT suplementado com albumina e SFB foram os que
obtiveram taxa de infecção mais elevadas. Diante dos dados obtidos em nosso trabalho o
meio de cultura LIT suplementando com SFB, serio o meio de cultura mais indicado para
cultivo e utilização dos parasitos da espécie L. infantum para ensaios de infecção in vitro e in
vivo.
Descrição
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa de Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.
Palavras-chave
Leishmania, Microbiologia - cultura e meios de cultura, Albumina
Citação
COSTA, Ana Flávia Pereira. Influência de diferentes meios de cultura axênicos no crescimento, viabilidade e infectividade de Leishmania (Leishmania) infantum. 2019. 115 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) - Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2019.