Métodos proteômicos aplicados à análise composicional e controle de qualidade da LBSap, preparação vacinal anti Leishmaniose Visceral Canina.

Abstract

A preparação vacinal LBSap consiste de um antígeno particulado de promastigotas de Leishmania braziliensis (cepa MHOM/BR/1975/M2903), rompidas por sonicação e administradas juntamente com o adjuvante saponina. A partir de estudos de fase clínica I e II em cães, foi demonstrado o potencial imunogênico da LBSap e obtido registro de patente em 2006. Com o início dos testes em escala industrial junto à empresa Ouro Fino Agronegócios, surgiram alguns questionamentos quanto ao controle composicional dessas amostras quando submetidas a diferentes condições tais como filtração terminal do produto, possibilidade de envase do imunobiológico com saponina em mesmo vial e temperatura de estocagem. Este trabalho propõe uma metodologia capaz de avaliar o proteoma total das preparações de LBSap produzidas industrialmente para detecção de variações na composição molecular quando submetida aos diferentes tratamentos. Proteômica shotgun foi ferramenta de escolha para as análises em larga escala empregando-se a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS, nanoHPLC Q-Exactive). Por meio do software PEAKS Studio e do banco de dados do proteoma de L. braziliensis realizou-se identificação e quantificação label-free obtendo-se no total 1.654 proteínas comuns a essas amostras o que representa 20% do proteoma da leishmania. Os parâmetros de quantificação permitiram a comparação das diferentes formulações e avaliação de reprodutibilidade entre réplicas. No total, 451 grupos de proteínas foram diferencialmente identificados. Diferenças marcantes de quantificação foram encontradas na amostra estocada à 37°C, com diminuição no nível de proteínas possivelmente resultante de degradação, quando comparada às amostras estocadas a 4°C. Experimentos de Western Blotting mostraram que o perfil de imunorreatividade é menor nas amostras contendo saponina e armazenadas à 37ºC, quando comparado às demais, reforçando os achados de degradação. O processo de filtração terminal do produto não afetou significativamente a composição, sendo que apenas 6 proteínas abundantes foram diferencialmente identificadas. A estratégia de proteômica shotgun apresentou-se como uma ferramenta útil para determinação da composição molecular de LBSap e deve direcionar ações para desenvolvimento do controle de qualidade dessa formulação vacinal.