Análise proteômica do secretoma de Leishmania infantum e ensaios preliminares para a descoberta de biomarcadores da Leishmaniose visceral canina.

Abstract

As leishmanioses constituem um grupo heterogêneo de doenças que abrangem áreas tropicais e subtropicais, sendo endêmicas em 88 países com aproximadamente 12 milhões de infectados e 350 milhões de pessoas expostas ao risco. Por ano, cerca de 1.500.000 casos de leishmaniose tegumentar e 500.000 casos de leishmaniose visceral (LV) são relatados. Os cães, os principais reservatórios domésticos, são considerados o principal elo na cadeia de transmissão da LV. A partir da disponibilidade dos dados de sequenciamento dos genomas de algumas espécies de Leishmania (L. major, L. infantum e L. braziliensis), ferramentas na área da proteômica podem ser empregadas para a identificação de novas proteínas com potencial para o diagnóstico, prognóstico e/ou o desenvolvimento de vacinas contra a leishmaniose. O foco do presente estudo constituiu a caracterização molecular do secretoma da espécie L. infantum, utilizando-se de uma abordagem proteômica. Promastigotas em fase log de crescimento foram submetidos ao cultivo sob duas condições experimentais. A primeira, nas condições normais de cultivo de promastigotas (pH 7.2 e temperatura de 26ºC) e, para a segunda, utilizando condições para mimetizar o microambiente de um fagolisossomo (pH 5.5 e temperatura de 35ºC). A homogeneidade do secretoma foi avaliada a partir da contagem de parasitos viáveis, durante diferentes tempos de cultivo, empregando marcação por iodeto de propídeo e citometria de fluxo. A técnica de marcação revelou que durante 8h de cultivo a percentagem de parasitos viáveis manteve-se aproximadamente 94%. A fração do sobrenadante de cultura, obtido durante 6h em pH 7.2, foi submetida à digestão em solução utilizando tripsina. Os peptídeos resultantes foram separados usando cromatografia de fase reversa e detectados para fragmentação a partir de uma interface acoplada ao espectrômetro de massas operando via electrospray. Após busca de homologia em bancos de dados foram identificadas 135 proteínas, as quais foram classificadas em 9 categorias funcionais e 1 hipotética. Dados sobre abundância relativa permitiram concluir que o secretoma de L. infantum está representado por basicamente três categorias (1) metabolismo de nucleotídeos, (2) metabolismo de carboidratos e (3) outros processos. Sessente e três proteínas foram submetidas à análises de bioinformática para predição de sinais moleculares indicativos de secreção, por meio de vias clássicas e não clássicas. Cerca de 50% das proteínas investigadas são potencialmente secretadas, das quais, 30% atingem o meio extracelular por vias não clássicas. Soros de animais naturalmente infectados, portadores de diferentes formas clínicas da LVC, foram utilizados para testar a imunogenicidade associada aos secretomas de L. infantum e L. amazonensis. Experimentos de Western blotting mostraram que ambas as preparações são úteis na identificação de animais portadores de LVC. Além disso, as mesmas frações podem ser utilizadas na discriminação de animais sintomáticos, daqueles portadores de outras formas clínicas da doença. Coletivamente, a caracterização molecular do secretoma de L. infantum e os ensaios preliminares de imunoproteômica abriram novas possibilidades de investigação relacionadas ao tratamento, prognóstico e diagnóstico da LVC.