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Título: Cromatografia de afinidade pelo ácido ε-aminocapróico para purificação e depleção de anticorpos em condições otimizadas para preservação estrutural e funcional.
Autor(es): Neves, Leandro Xavier
Orientador(es): Borges, William de Castro
Andrade, Milton Hércules Guerra de
Palavras-chave: Genõmica
Proteômica
Data do documento: 2014
Membros da banca: Borges, William de Castro
Fonseca, Cristina Toscano
Castro, Ieso de Miranda
Referência: NEVES, Leandro Xavier. Cromatografia de afinidade pelo ácido ε-aminocapróico para purificação e depleção de anticorpos em condições otimizadas para preservação estrutural e funcional. 2014. 112 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) – Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2014.
Resumo: Imunoglobulinas ou anticorpos são glicoproteínas produzidas pelas células B. Estas moléculas podem ser encontradas ancoradas na membrana plasmática da célula produtora ou em fluidos corporais, como sangue e líquido ascítico, na sua forma secretada. Sua estrutura tridimensional revela uma organização básica correspondente à associação das cadeias polipeptídicas leve e pesada. A capacidade de reconhecimento molecular altamente específico faz dessas moléculas poderosas ferramentas nas ciências biomédicas, sendo úteis nas pesquisas científicas, métodos de diagnóstico e imunoterapias. Anticorpos são obtidos a partir de soro de animais ou culturas celulares após rigorosas etapas de purificação, que se destinam à remoção de contaminantes comuns como vírus, pirogênios e proteínas abundantes. Particularmente, o isolamento de anticorpos utilizando cromatografia de afinidade permite sua purificação e depleção em amostras de plasma, precedendo as análises proteômicas. Embora vários procedimentos para purificação/depleção de anticorpos estejam atualmente disponíveis, algumas limitações como especificidade restrita à determinadas classes e espécies e alto custo, justificam o desenvolvimento de métodos alternativos. O objetivo deste trabalho foi a síntese de matrizes cromatográficas, utilizando ácido ε-aminocapróico (AEAC), para purificação e depleção de anticorpos. Quatro, das cinco, matrizes obtidas exibiram especificidade por anticorpos plasmáticos humanos e IgY da gema do ovo de Gallus gallus. O emprego de condições cromatográficas brandas, especialmente eluição em pH fisiológico e baixa força iônica, permitiu a recuperação de anticorpos funcionais, como revelado por Western blotting. O perfil eletroforético bidimensional, seguido da análise por espectrometria de massas, revelou uma heterogeneidade de isoformas e a purificação dos isotipos humanos IgG1,2,3,4, IgA1, IgD, IgM e IgY de Gallus gallus, com alto grau de pureza. Além disso, a imobilização do ácido ε-aminocapróico em micropartículas magnéticas constitui uma estratégia bem sucedida de depleção plasmática de anticorpos, a partir de pequenos volumes. Por último, a avaliação do desempenho das matrizes sintetizadas revelou a melhor capacidade de retenção da matriz pré-ativada NHS-AEAC (30 mg de anticorpo/g). Concluímos que o acoplamento do ácido ε-aminocapróico em suportes cromatográficos constitui uma alternativa para a purificação e depleção de anticorpos plasmáticos e IgY, revelando-se como uma nova ferramenta de interesse biotecnológico.
Resumo em outra língua: Immunoglobulins or antibodies are glycoproteins produced by B-cells. They can be found anchored to the plasma membrane or secreted in body fluids such as blood and ascites. The basic tridimensional structures of these molecules display a conserved assembly, corresponding to the association of light and heavy polypeptide chains. Due to their highly specific binding properties, antibodies are powerful tools in biomedical sciences with applications on research, diagnosis and immunotherapy. They are usually obtained from animal sera or cell culture after rigorous purification steps aiming to exclude commonly found contaminants such as viruses, pyrogens and highly abundant proteins. In particular, isolation of antibodies using affinity chromatography allows their purification and parallel depletion from plasma samples, prior to proteomic analyses. Although various antibody purification/depletion methods are currently available, some limitations such as restricted specificity to antibody classes or animal species and high cost, justify the development of alternative isolation approaches. The focus of the present study was the synthesis of chromatographic supports containing immobilized ε-aminocaproic acid (AEAC) for purification and depletion of antibodies. Four out of five produced chromatographic matrices demonstrated specificity to human plasma antibodies and IgY from Gallus gallus egg yolk. Under mild chromatographic conditions, e.g - elution at physiological pH and low ionic strength, functional antibodies were recovered as judged by Western blotting. A 2D SDS-PAGE profile followed by mass spectrometry analyses revealed a great heterogeneity of antibody isoforms and the isolation of the human isotypes IgG1,2,3,4, IgA1, IgD, IgM and IgY from Gallus gallus, at high purity. Moreover, aiming to deplete antibodies from micro-volume plasma samples, magnetic particles bearing ε-aminocaproic acid were also produced and proved successful. At last, performance evaluation of the synthetic matrices revealed the NHS-activated-AEAC as exhibiting the best binding capacity (30 mg antibody/g). In conclusion, coupling of ε-aminocaproic acid in the various matrices constituted suitable alternatives for purification and depletion of plasma antibodies and IgY. It is anticipated these findings may potentially raise biotechnological interest.
Descrição: Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa de Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.
URI: http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/9477
Licença: Autorização concedida ao Repositório Institucional da UFOP pelo autor, 15/01/2015, com as seguintes condições: disponível sob Licença Creative Commons 4.0, que permite copiar, distribuir e transmitir o trabalho, desde que seja citado o autor e licenciante. Não permite o uso para fins comerciais nem a adaptação desta.
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