Metodologia para ensaios de candidatos vacinais contra leishmaniose visceral canina pelo co-cultivo de linfócitos e macrófagos infectados com Leishmania chagasi.

Abstract

Nos últimos 30 anos, a leishmaniose visceral (LV) tem avançado para áreas urbanas e periurbanas, apontando o cão como principal reservatório da L. chagasi (sin. L. infantum). Neste contexto, pesquisadores consideram como consenso que uma vacina contra a leishmaniose visceral canina (LVC) poderia ser uma importante ferramenta no controle tanto da leishmaniose humana como canina. Por esta razão, foi desenvolvido um novo método para avaliar o sistema imune de cães que poderia ser empregado como uma alternativa para se analisar imunogenicidade e níveis de proteção em candidatos vacinais contra a LVC. Para tanto, foram empregadas células mononucleares do sangue periférico CMSP de cães saudáveis para padronização de: (i) condições in vitro de cultivo de monócitos diferenciados em macrófagos de cães (MD-MC) infectados previamente com L. chagasi e avaliados após 3, 24, 48, 72 e 96h da infecção nos tempos de 2, 3, 4 e 5 dias de diferenciação do MD-MC (n=5 cães saudáveis); (ii) purificação de subpopulações de células T (CD4+ e CD8+) considerando a razão de linfócitos:macrófagos variando de 1:5 a 2:1 (n=12 cães saudáveis). Em todos os experimentos foram utilizados sobrenadante de cultura para analisar diferentes biomarcadores imunológicos, tais como: níveis de óxido nítrico, a produção de mieloperoxidase (MPO) e N-acetilglicosaminidase (NAG); citocinas do tipo 1 (IFN-, TNF-, IL-12), tipo 2 (IL-4) e imunomodulatórias (IL-10); e avaliada a frequência do parasitismo e carga parasitária em MD-MC infectados com L. chagasi. Os resultados revelaram que após 5 dias da diferenciação do MD-MC e 72h da infecção por L. chagasi foi observado um melhor perfil morfológico e da habilidade microbicida. Apesar dos níveis de NAG permanecerem praticamente inalterados, a análise do MPO revelou redução significativa no tempo de cinco dias de diferenciação dos MD-MC, indicando a baixa contaminação por granulócitos neste período. Os experimentos de co-cultivo empregando MD-MC e subpopulações de células T mostrou um perfil marcante nos biomarcadores imunológicos e na atividade microbicida, considerando a razão de linfócitos (CD4+ ou CD8+) : macrófagos de 1:2 e 1:1:1 de linfócitos (CD4+ e CD8+) : macrófagos. Assim, nestas condições do co-cultivo foi observado associação entre a produção de óxido nítrico e os níveis de citocinas do tipo 1, tipo 2 e imunomodulatórias com a manutenção de uma frequência de parasitismo intermediária e estabilização da carga parasitária em MD-MC infectados por L. chagasi. Os dados obtidos com a realização deste trabalho estimulam a continuidade dos estudos empregando esta metodologia de MD-MC co-cultivados com células T CD4+ e/ou CD8+ provenientes de CMSP de cães imunizados com candidatos vacinais contra LVC.