Efeito do PSI na inibição do proteassoma 20S de Trypanosoma cruzi.

Abstract

As proteases dos parasitos protozoários têm recebido um foco especial nas últimas décadas como potenciais alvos terapêuticos. Uma delas, o proteassoma 20S, é uma protease compartimentalizada que tem um papel crucial na biologia celular, regulando vários processos, dentre eles, a degradação de proteínas de meia vida curta, a progressão do ciclo celular e a apresentação de antígenos. Neste sentido, este trabalho teve como objetivo geral avaliar o padrão de expressão e a atividade peptidásica desta protease, bem como o impacto da inibição do proteassoma com PSI, um inibidor clássico da atividade quimotripsina, na proliferação in vitro e na evolução da infecção experimental de camundongos Swiss inoculados com as cepas Y, Berenice-62 e Berenice-78 de Trypanosma cruzi. A análise por RT-PCR, utilizando oligonucleotídeos específicos para as subunidades catalíticas do proteassoma 20S (semelhantes à caspase, tripsina e quimotripsina), RNA total das formas epimastigotas obtidas das cepas Y, Be-62 e Be- 78, e do gene hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase como normalizador, mostraram níveis equivalententes de mRNA para estas subunidades. Por outro lado, utilizando a técnica de Western blot e anticorpos específicos para as subunidades do tipo alfa (1, 2, 3, 5, 6 e 7), foi evidenciada uma maior abundância de proteassoma 20S na cepa Be-78 quando comparada às cepas Y e Be-62. Estas diferenças nas quantidades absolutas de proteassoma foram confirmadas pela medida das respectivas atividades peptidásicas, utilizando susbtratos específicos e uma fração enriquecida de proteassoma. Os nossos resultados confirmam a atividade tripsina como a principal em epimastigota de T. cruzi e também sugerem que esta protease pode ser regulada por mecanismos póstranscricionais. A seguir, para a avaliação do efeito da inibição do proteassoma na replicação das formas epimastigota ao meio LIT contendo 3x106 parasitos, foram adicionadas concentrações que variaram entre 0,033 a 50μM de PSI. Foi observada uma redução da proliferação de 90% para as cepas Y e Be-78 quando comparados aos grupos controles. Entretanto, a cepa Be-62 apresentou uma redução da proliferação de 57% na concentração de 0,033μM e de 73% na concentração de 0,083μM. Esses resultados sugerem que um proteassoma funcional é essencial para a replicação das formas epimastigotas. Posteriormente, estes parasitos foram analisados por microscopia eletrônica de varredura. Foi observado o desligamento do corpo celular do parasito do seu flagelo, rugosidade acentuada em suas membranas celulares, bem como deformações na parte anterior do corpo celular, sugerindo que a inibição do proteassoma induz um desequilíbrio no turnover das proteínas envolvidas na manutenção do corpo do parasito. Finalmente foi analisado o efeito da inibição do proteassoma na evolução da infecção experimental da Doença de Chagas. Inicialmente, os tripomastigotas sanguíneos foram incubados com 100μM de PSI durante 20 minutos e posteriormente 5x103 parasitos foram inoculados em camundongos Swiss. Foi observada uma redução do número de parasitos de 68%, 42%, 73% no pico de parasitemia das cepas Y, Be-62 e Be-78, respectivamente. Esses resultados corroboram as diferenças bioquímicas iniciais observadas entre o proteassoma destas cepas. A análise do parasitismo tecidual e do processo de inflamação no baço, fígado músculo cardíaco e esquelético mostrou que na cepa Y o grau de parasitismo dos camundongos infectados com tripomastigotas pré-incubadas com PSI foi maior quando comparado ao grupo controle, porém, com um processo inflamatório que não acompanhou este quadro. Entretanto, quando foi utilizada a cepa Be-62, foi observado um aumento acentuado do parasitismo no fígado e baço acompanhados por uma exacerbação do processo inflamatório, quando comparado ao grupo controle. Este padrão não foi observado para a cepa Be-78, que apresentou comparada ao grupo controle, uma manutenção do padrão de parasitismo tecidual bem como do processo inflamatório. Em conjunto, nossos dados sugerem que o proteassoma é essencial para a manutenção do ciclo biológico do T. cruzi, uma vez que a inibição desta protease na fase replicativa (epimastigota), além de bloquear o ciclo celular, induz alterações morfológicas, enquanto que uma inibição na fase infectiva, compromete a progressão da infecção experimental.