Análise bioinformática de transcritos da glândula de veneno da aranha – marrom Loxosceles intermedia e construção de baculovírus recombinantes como vetores de toxinas inseticidas.

Abstract

Neste trabalho, objetivando a caracterização molecular de transcritos da glândula de veneno da aranha-marrom Loxosceles intermedia para a ampliação do banco de dados de toxinas, 268 seqüências foram agrupadas em 136 singlets e 33 consensos. Estas seqüências foram submetidas à anotação gênica para que fossem identificadas por meio de buscas de similaridade contra diferentes bancos de dados. Em seguida, foram classificadas em categorias funcionais, analisadas quanto a sua função biológica e, quando possível, modeladas por homologia para que verificássemos sua provável estrutura tridimensional. Além disso, a fim de produzir bioinseticidas de alta eficiência e especificidade, trabalhamos com toxinas de atividade letal para insetos de importância agrícola. Recentemente, a partir da purificação do veneno bruto de L. intermedia e da construção de uma biblioteca de cDNA das glândulas de veneno desta aranha, nosso grupo caracterizou toxinas com forte ação inseticida em larvas de Spodoptera frugiperda, a lagarta-do-cartucho do milho. Devido às dificuldades para se obter do veneno bruto as toxinas identificadas por biologia molecular, o uso de sistemas de expressão heterólogos torna-se necessário tanto para o estudo dos genes isolados dessas toxinas quanto para a sua obtenção em grandes quantidades. Um dos sistemas heterólogos de controle a pragas mais estudados em nível nacional e internacional é aquele que utiliza baculovírus no combate a diversas pragas agrícolas. O sistema baculovírus supera em vários aspectos os sistemas tradicionais de inseticidas químicos, sendo considerado por diversos autores como seguro ao meio ambiente e ao homem e, também, apresentando potencialmente um custo final por hectare menor do que o dos inseticidas químicos. Assim, realizamos - através da subclonagem em vetores de transferência do sistema de expressão baculovírus - a inserção dos genes das toxinas inseticidas LiTx1, LiTx2 e LiD1 (previamente identificadas a partir da glândula de veneno de L. intermedia) ao genoma do baculovírus AcMNPV. O sucesso da construção dos vírus recombinantes foi verificado após infecção de células de inseto e também por PCR. A expressão das toxinas LiTx1, LiTx2 e LiD1 foi verificada por RT-PCR, SDS-PAGE e Western Blotting. Bioensaios com os vírus recombinantes LiTx1 e LiTx2 em larvas de S. frugiperda demonstraram sua eficácia inseticida, com diminuição do tempo de vida desta lagarta, quando comparada aos vírus selvagens. Acreditamos que os baculovírus recombinantes aqui gerados poderão permitir a expressão em larga escala das toxinas LiTx1, LiTx2 e LiD1 de L. intermedia. Isso possibilitará a realização de estudos de caracterização dessas toxinas inseticidas quanto aos seus mecanismos de ação e permitirá também sua utilização como ferramentas na pesquisa básica para estudos de canais iônicos e outros processos fisiológicos.