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Título: Caracterização das subunidades catalíticas do proteassoma 20S em cepas de Trypanosoma cruzi susceptíveis e resistentes ao benzonidazol.
Autor(es): Oliveira, Cássio Barros
Orientador(es): Cota, Renata Guerra de Sá
Palavras-chave: Trypanosoma cruzi
Drogas - resistência
Data do documento: 2007
Editora / Evento / Instituição: Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.
Referência: OLIVEIRA, C. B. Caracterização das subunidades catalíticas do proteassoma 20S em cepas de Trypanosoma cruzi susceptíveis e resistentes ao benzonidazol. 2007. 65 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2007.
Resumo: A doença de Chagas é causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi. Segundo a WHO existem 16-18 milhões de pessoas infectadas com este protozoário na América Latina. Devido ao envolvimento do proteassoma na biologia celular do T. cruzi e a baixa eficiência das drogas utilizadas no tratamento de indivíduos com doença de Chagas, entendemos que a caracterização das subunidades catalíticas do proteassoma 20S, poderá ajudar no desenvolvimento de futuros quimioterápicos contra essa doença. Neste sentido, este trabalho mostra a caracterização molecular e bioquímica das subunidades catalíticas do proteassoma 20S em um padrão de cepas do T. cruzi com sensibilidade e resistência induzida “in vitro” ao benzonidazol (17WTS e 17LER), sensibilidade e resistência selecionada “in vivo” ao benzonidazol (BZS e BZR) e cepas naturalmente sensíveis e resistentes a essa droga (CL e Colombiana, respectivamente). As análises de localização cromossômica utilizando a técnica de eletroforese em gel de campo alternado, mostraram vários perfis de hibridização, sugerindo que estes genes não estão associados com o fenótipo de resistência do T. cruzi a drogas. Além disso, utilizando a técnica de Southern blot, mostramos que estes genes estão presentes em no mínimo duas cópias por genoma haplóide do parasito. A expressão desses genes foi avaliada através da técnica de Northern blot e os níveis do proteassoma 20S identificados utilizando Western blot e anticorpos contra subunidades alfa. Podemos constatar que enquanto os níveis de mRNA não variaram entre as cepas, uma maior quantidade de proteassoma 20S foi detectado nas cepas sensíveis (17WTS, BZS e CL) quando comparado as cepas resistentes (17LER, BZR e Colombiana). Além disso, também não detectamos acúmulo de conjugados poliubiquitinados, sugerindo que o processo de poliubiquitinação e degradação de proteínas intracelulares dependente do proteassoma 26S são fortemente regulados no padrão de cepas de T. cruzi estudadas. A medida da atividade peptidásica utilizando substratos específicos para as subunidade Beta-1, -2 e -5, mostraram uma atividade peptidásica principal semelhante à tripsina em todas as cepas analisadas, entretanto, as cepas 17WTS e 17LER também apresentaram uma alta atividade peptidásica semelhante à quimotripsina. Os resultados obtidos até o momento, sugerem que modificações póstraducionais são mais eficientes na função do proteassoma 20S do que a regulação ao nível transcricional ou pós-transcricional, na forma epimastigota do T. cruzi.
Resumo em outra língua: Chagas disease is caused by Trypanosoma cruzi. According to WHO, in Latin America, 16-18 million people is infected with this protozoan. Due the involvement of the proteasome in the cellular biology of the T. cruzi and the low efficiency of the drugs used in the individuals treatment with Chagas disease, we believed that the characterization of the catalytic subunits of the 20S proteasome, would help in the development of future drugs that could be used in the therapeutics of the Chagas disease. This work shows the molecular and biochemical characterization of the catalytic subunits of the 20S proteasome in a T. cruzi population with in vitro induced (17WTS and 17LER), in vivo (BZS and BZR) and strains naturally sensitive and resistant to benznidazole (CL and Colombian). Chromosomal localization by using the pulse field gel electrophoresis and hybridization profiles with specific probes showed several pattern in the different strains, suggesting that these genes are not associated with the drugs phenotype resistance in T. cruzi. Southern blot analyses showed that these genes are present in at least two copies for genome haploid of the parasite. The expression of those genes was evaluated through of Northern blot analyses and the levels of the 20S proteasome identified using Western blot and antibodies against alpha subunits. The mRNA levels did not vary among the strains, but a larger level of 20S proteasome were detected in the sensitive strains (17WTS, BZS and CL) when compared the resistant strains (17LER, BZR and Colombian). The absent of accumulation of poly-ubiquitin conjugated, suggest that the poly-ubiquitination pathway and degradation by 26S proteasome, are strongly regulated in the strains of T. cruzi studied. The measure of the peptidase activity using specific substrate for the subunit Beta-1, -2 and -5, showed that the main proteolytic activity is tripsin-like in all strains. Moreover, the strains 17WTS and 17LER also presented a high quimotripsin-like activity. These results obtained until the moment suggest that, in the epimastigote development stage of the T. cruzi the post-translation modifications are more efficient by the regulation of 20S proteasome function than the transcriptional or posttranscriptional modification.
URI: http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/2582
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