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Título: Produção e análise de partículas sub-micrométricas poliméricas em modelo murino com potencial aplicação em vacinas anti-Leishmania.
Autor(es): Silva, João Guilherme Lino da
Orientador(es): Giunchetti, Rodolfo Cordeiro
Mosqueira, Vanessa Carla Furtado
Palavras-chave: Nanotecnologia
Leishmaniose
Data do documento: 2014
Membros da banca: Giunchetti, Rodolfo Cordeiro
Luca, Paula Mello de
Silva, André Talvani Pedrosa da
Referência: SILVA, João Guilherme Lino da. Produção e análise de partículas sub-micrométricas poliméricas em modelo murino com potencial aplicação em vacinas anti-Leishmania. 2014. 109 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) – Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2014.
Resumo: A leishmaniose visceral é causada pela Leishmania chagasi (sinonímia Leishmania infantum) e para se evitar a transmissão da doença, o desenvolvimento da vacina anti-leishmaniose visceral canina (LVC) é considerada a principal estratégia racional. Neste contexto, diferentes estudos propõem que seria possível um incremento na imunogenicidade vacinal anti-Leishmania ao se realizar o encapsulamento do antígeno. O objetivo deste estudo foi produzir partículas sub-micrométricas (SMP), com potencial para encapsular antígenos candidatos contra Leishmania em modelo murino e analisar o perfil inflamatório e toxicidade. Neste contexto foi realizada a produção de partículas a partir da reação entre a fase oleosa, contendo diferentes concentrações de Ácido Polilático (PLA) e acetona, e a fase aquosa, contendo diferentes concentrações de quitosana, antígeno de Leishmania braziliensis e água. Após evaporação do solvente, o tamanho das partículas foi analisado por espectroscopia de correlação de fótons, após diluição das amostras em água ultra-pura. O tamanho das SMPs obtidas variou entre 200nm e 1200μm, demonstrando variação dependente da concentração dos constituintes utilizados. Além disso, foi obtido potencial zeta variando entre +57,0 e +71,6, apresentando 64% de eficiência de encapsulamento antigênico, o que demonstrou a elevada plasticidade dos materiais usados na produção das partículas. Desta maneira, foi realizada análise da toxicidade e perfil inflamatório. Nesta etapa, foram analisados três grupos (n=5/tempo) de camundongos BALB/c, que foram acompanhados por até 72 horas após o inóculo intradérmico. Vale destacar que os diferentes inóculos foram realizados na região dorso-lombar, em volume de 100L, sendo avaliados os seguintes grupos experimentais: (i) grupo controle (C) inoculado com de solução salina estéril 0,85%, (ii) grupo partícula branca 1 (PB1) composto pelo inóculo correspondente a solução de SMP capazes de encapsular 60μg de antígeno de L. braziliensis, medindo em torno de 800nm, e, (iii) grupo partícula branca 2 (PB2) composto pelo inóculo correspondente a solução de SMP capazes de encapsular 60μg de antígeno de L. braziliensis, medindo em torno de 400nm. As análises, após os diferentes inóculos, foram realizadas em cinco tempos distintos (1/6/24/48/72 horas). Assim, após cada um dos tempos os animais foram submetidos a eutanásia para coleta de material biológico. Neste sentido, o soro foi coletado antes e após 72 horas dos diferentes inóculos para análise da função hepática (ALT, AST) e renal (ureia e creatinina). Além disto, após os diferentes tempos avaliados, um fragmento de pele da região do inóculo foi destinado a histopatologia, análise de ativação celular por NAG e MPO, e dosagem de citocinas. Não foram observadas alterações locais (nódulo ou ulceração), clínicas e comportamentais, bem como na função hepática e renal. Em relação as análises histopatológicas, a cinética inflamatória revelou infiltrado polimorfonuclear moderado no grupo C, com redução da inflamação local, em 24 horas. Para as PB1 e PB2, após 48 horas do inóculo, foi observado um infiltrado polimorfonuclear variando de moderado a intenso, com hiperemia, macrófagos e linfócitos distribuídos em toda a derme. Após 72 horas do inóculo houve resolução da inflamação no grupo PB1. Por outro lado, o grupo PB2 apresentou manutenção do infiltrado inflamatório, com redução de polimorfonucleares e aumento de células mononucleares, confirmados pela análise dos níveis NAG e MPO (macrófagos e neutrófilos, respectivamente) e presença das citocinas IL-6 e TNF-α. Diante do exposto, neste estudo foi possível concluir que ambas as PSM avaliadas (PB1 e PB2) são potenciais indutoras de inflamação local, sem causar alterações locais e sistêmicas aos animais. Deste modo, estas partículas poderiam ser utilizadas em formulações vacinais anti-Leishmania apresentando a vantagem de desencadear reação inflamatória local (efeito adjuvante), além de serem capazes de encapsular antígenos de L. braziliensis.
Resumo em outra língua: Visceral leishmaniasis is caused by Leishmania chagasi (synonym Leishmania infantum) and to prevent the transmission of this disease, the development of anti-canine visceral leishmaniasis (CVL) vaccine is considered the main rational strategy. In this context, several studies suggest that it would be possible an increase in anti-Leishmania vaccine immunogenicity when performing encapsulation of the antigen. The aim of this study was to produce and analyze the inflammatory profile and toxicity of sub-micrometer particles (SMP) with the potential to encapsulate candidate antigens against Leishmania in a murine model. In this context, particle production was carried out from the reaction between the oily phase, containing different concentrations of polylactic acid (PLA) and acetone, and the aqueous phase, containing different concentrations of chitosan, Leishmania braziliensis antigen and water. After evaporation of solvent, the particle size was analyzed by photon correlation spectroscopy after diluting the samples in ultra-pure water. The size of SMPs obtained varied between 200nm and 1200μm, demonstrating variation dependent of concentration of constituents used. In addition, the zeta potential was obtained ranging between +57.0 and +71.6, with 64% efficiency of antigen encapsulation, which demonstrated the high plasticity of the materials used in the production of the particles. Thus, analysis of the toxicity and inflammatory profile was performed. At this stage, three groups (n=5/time) of BALB/c mice, who were followed for up to 72 hours after intradermal inoculation were analyzed. The different inoculations were performed in the dorsal-lumbar region (volume 100μL). The following experimental groups studied were: control group (C) inoculated with sterile saline 0.85% (i), (ii) white particle group 1 (PB1) comprises the corresponding inoculum solution SMP capable of encapsulating 60μg antigen of L. braziliensis measuring about 800nm, and (iii) white particle group 2 (PB2) comprises the corresponding inoculum solution SMP capable of encapsulating 60μg of the L. braziliensis antigen, measuring around 400nm. The analysis after the different inocula were made at five different times (1/6/24/48/72 hours). Thus, after each time the animals were euthanized for collection of biological material. In this sense, serum was collected before and 72 hours after the different inocula for analysis of liver function (ALT, AST) and kidney (urea, creatinine). In addition, after the different time periods studied, a fragment of the skin region of the inoculum was intended for histopathology analysis of cell activation by NAG and MPO, and measurement of cytokines. Nonlocal (lump or ulceration), clinical and behavioral changes were observed, as well as liver and kidney function was regular. Regarding the histopathological analysis, the inflammatory infiltrate kinetics revealed moderate polymorphonuclear in group C, with reduced local inflammation in 24 hours. PB1 and PB2 showed 48 hours after inoculation a polymorphonuclear infiltrate ranging from moderate to intense, with hyperemia, macrophages and lymphocytes distributed throughout the dermis. After 72 hours it was observed resolution of inflammation in PB1 group. On the other hand, the PB2 group showed maintenance of the inflammatory infiltrate, with reduction of polymorphonuclear and increase of mononuclear cells, as confirmed by analysis of NAG and MPO levels (macrophages and neutrophils, respectively) and the presence of IL-6 and TNF-α. Given the above, in this study it was concluded that both the evaluated SMPs (PB1 and PB2) are potential inducers of local inflammation without causing local and systemic changes to animals. Thus, these particles could be used in vaccine formulations against Leishmania and have the advantage of eliciting a local inflammatory response (adjuvant effect), and are able to encapsulate antigens of L. braziliensis.
Descrição: Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa de Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.
URI: http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/10000
Licença: Autorização concedida ao Repositório Institucional da UFOP pelo(a) autor(a) em 15/06/2018 com as seguintes condições: disponível sob Licença Creative Commons 4.0 que permite copiar, distribuir e transmitir o trabalho desde que sejam citados o autor e o licenciante. Não permite a adaptação.
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